單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析（scRNA-seq）盡管是一項(xiàng)相當(dāng)年輕的技術(shù)，但商業(yè)化的scRNA-seq平臺正在不斷涌現(xiàn)，而生物信息學(xué)方案也越來越多?，F(xiàn)在就讓我們來盤點(diǎn)一下zui新的研究進(jìn)展。

SPLiT-seq：成本低至一美分

      艾倫腦科學(xué)研究所的副主任Bosiljka Tasic指出，全基因組的單細(xì)胞分析目前很受歡迎。它讓人們了解整個(gè)系統(tǒng)中的單個(gè)組分，也就是單細(xì)胞。與PCR和原位雜交等技術(shù)不同，全基因組分析無偏向地告知了細(xì)胞正在表達(dá)什么，而不需要你去選擇分析什么。

      現(xiàn)在有許多平臺和技術(shù)可用于制備測序用的單細(xì)胞RNA。這些技術(shù)大體是在微孔板的各個(gè)孔中分離單個(gè)細(xì)胞，或者使用微滴來充當(dāng)單個(gè)細(xì)胞的反應(yīng)室。無論采用哪種方式，Tasic認(rèn)為關(guān)鍵是在分析的某個(gè)時(shí)刻將細(xì)胞分離并添加條形碼，這樣才能將RNA序列分配到它們當(dāng)初來源的那個(gè)細(xì)胞。

      Bosiljka Tasic聯(lián)合華盛頓大學(xué)的Georg Seelig團(tuán)隊(duì)開發(fā)出一種稱為SPLiT-seq的技術(shù)，其中細(xì)胞本身作為反應(yīng)室。這種技術(shù)將細(xì)胞或細(xì)胞核固定，以便捕獲RNA，不過洗滌試劑可以進(jìn)進(jìn)出出。通過一系列合并和分離的步驟，它開展逆轉(zhuǎn)錄并連接條形碼標(biāo)簽，zui終進(jìn)行裂解和PCR（使用條形碼引物）。

      SPLiT-seq技術(shù)于今年3月發(fā)表在《Science》雜志上。據(jù)Tasic介紹，這是一種低成本的技術(shù)，每個(gè)細(xì)胞的建庫成本低至一美分（約合人民幣七分錢），大大降低了實(shí)驗(yàn)室開展單細(xì)胞分析的門檻。“真正強(qiáng)大的是它幾乎無需任何特殊儀器，”Tasic補(bǔ)充說。

     研究團(tuán)隊(duì)利用SPLiT-seq技術(shù)對出生后第2天和第11天小鼠大腦和脊髓組織的細(xì)胞核進(jìn)行分析。他們成功地鑒定出100多種細(xì)胞類型，其基因表達(dá)模式與細(xì)胞功能、區(qū)域特異性和分化階段相對應(yīng)。這些數(shù)據(jù)可用于創(chuàng)建基因表達(dá)圖譜，與艾倫研究所的其他參考圖譜互補(bǔ)。

snDrop-seq：單核RNA測序

      加州大學(xué)圣地亞哥分校的張鹍（Kun Zhang）團(tuán)隊(duì)則關(guān)注人體組織的單細(xì)胞分析?！澳阈枰獙⒓?xì)胞彼此分離，才能開展各種單細(xì)胞分析，”他說。不過，大腦組織很難解離，“這就使結(jié)果存在很大的偏向性，因?yàn)橛行┘?xì)胞分離，而有些細(xì)胞則彼此相連。相比之下，提取完整的細(xì)胞核則相對簡單”。

     他們采用了一種經(jīng)過改進(jìn)的snDrop-seq方案，希望破壞微滴中的核膜，并盡量避免RNA降解?！俺Ｒ?guī)的Drop-seq或10X Genomics方案不行，因?yàn)槟げ粫屏?，”張鹍解釋說。目前有幾種方法可以完成這項(xiàng)任務(wù)，比如改變微流體芯片，讓核膜在機(jī)械力作用下分解。“我們實(shí)際上提高了溫度來破壞核膜?！?

      他們同時(shí)開展了snDrop-seq和scTHS-seq，后者為染色質(zhì)開放性檢測?！斑@使得我們能夠在RNA水平和染色質(zhì)水平上比較這些單細(xì)胞，”張鹍指出。他們能夠重建各種腦細(xì)胞的表觀遺傳圖譜，并利用單細(xì)胞多組學(xué)方法將風(fēng)險(xiǎn)因素與特定的細(xì)胞類型相關(guān)聯(lián)，了解神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞對阿爾茨海默病、自閉癥或精神分裂癥等病的貢獻(xiàn)。

Smart-seq2：處理少量樣本

      Wellcome Sanger研究所的Adam Reid及其同事想要了解瘧疾生命周期中的遺傳控制。 通過測序不同步的單細(xì)胞并分析轉(zhuǎn)錄組，他們發(fā)現(xiàn)寄生蟲階段的發(fā)育實(shí)際上有很大的變化?！叭绻麑Υ罅縍NA進(jìn)行測序，這一點(diǎn)并不明顯，”研究人員談道。

     他們對低通量的Smart-seq2方案進(jìn)行了修改，目標(biāo)是分析每個(gè)階段的100個(gè)細(xì)胞。 Reid表示，與高通量的10X Genomics或Drop-seq平臺相比，“你可以獲得更多關(guān)于哪些基因表達(dá)以及表達(dá)豐度如何的信息”。

     引起瘧疾的瘧原蟲非常小，含有少量的RNA，并且基因組偏向性非常明顯，GC含量 低至20％，而哺乳動(dòng)物大約是35-40％。因此，建庫的試劑往往不能很好地發(fā)揮作用，不過通過增加PCR循環(huán)次數(shù)和嘗試不同的酶，研究人員還是很好地解決了這一問題。

生物信息學(xué)工具：ASAP

     人們也許會對scRNA-seq望而卻步，因?yàn)樾枰徺I復(fù)雜的儀器和掌握生物信息學(xué)流程。有時(shí)，生物學(xué)家和信息學(xué)家之間的溝通“非常糟”，瑞士生物信息學(xué)研究所的負(fù)責(zé)人Bart Deplancke回憶說。在準(zhǔn)備開展脂肪組織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究時(shí)，他們有許多數(shù)據(jù)集需要處理，卻發(fā)現(xiàn)其合作者往往無法開展。

     于是，他們著手安排合作，讓兩類研究人員能以更直觀的方式觀察和處理數(shù)據(jù)。他們開發(fā)出一個(gè)名為Automated Single-cell Analysis Pipeline（ASAP）的平臺。這是一個(gè)基于Web的完整流程，提供了標(biāo)準(zhǔn)工具，包括過濾、降維、聚類、差異表達(dá)和功能富集。它能夠與各種數(shù)據(jù)庫交互，并以2D或3D顯示結(jié)果?！皩τ诿總€(gè)步驟，我們都提供了基本教程，它將告訴你每種分析工具能做什么，”Deplancke說。

     他指出，“即使是生物信息學(xué)家也很喜歡用，因?yàn)樗軌蚩焖偬幚砗筒榭磾?shù)據(jù)。然后他們與生物學(xué)家一起觀察數(shù)據(jù)，提出一些新的假設(shè)，并通過實(shí)驗(yàn)或計(jì)算手段來進(jìn)一步證明它?！?