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實驗室常見的支原體檢測方法你了解嗎?

發(fā)布時間:2019-02-11瀏覽次數:1437返回列表

     支原體是一類能自我復制的zui小的原核生物,可透過一般過濾膜且對抗生素具有一定耐藥性,是原代細胞跟傳代細胞的常見污染物,其會改變細胞的 DNA、RNA 及蛋白表達。
 
     支原體污染嚴重危害科研學者們的勞動成果,早發(fā)現早處理,把損失降到zui低。《藥典三部 2015 版》-3301 支原體檢驗-要求應同時進行培養(yǎng)法和指示細胞培養(yǎng)法(DNA 染色法),也可采用檢驗機構認可得其他辦法。這里筆者來簡單介紹一下目前實驗室常見的支原體檢測方法:

 


 
1.培養(yǎng)法

培養(yǎng)法是通過將待檢測樣品先接種到支原體液體培養(yǎng)基中大量繁殖,然后再轉接種到支原體固體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)一段時間后(大約一個月),如果固體培養(yǎng)中出現典型的支原體菌落,則說明待測樣品有支原體污染。

2、RD-RCA 恒溫法(MycoBlue Mycoplasma Detector)

吸取 1 ul 細胞培養(yǎng)上清液加入到反應體系中,孵育 1 小時,若細胞培養(yǎng)物被支原體污染,支原體 DNA 保守系列會被等溫 DNA 聚合酶特異性擴增,使得反應液由紫色變成天藍色。肉眼可觀察。

3.熒光染色法(Mycoplasma Stain Assay Kit)

該方法主要是能與 DNA 特異性結合的熒光染料 Hoechst33342 或 Hoechst33258,可使支原體內 DNA 著色,染色后可用熒光顯微鏡觀察。

4.酶活法(TransDetect Luciferase Mycoplasma Detection Kit)
 
     支原體溶解時釋放出來的酶與 TransDetect Luciferase Mycoplasma Detection Kit 中提供的底物發(fā)生催化反應,將 ADP 轉化成 ATP,而 ATP 含量的上升,能通過生物發(fā)光化學反應檢測,并通過分光光度計進行讀數,從而達到檢測支原體的目的。
 
5. PCR 法(Genloci-Mycoplasma Detection Kit)
      
     利用對支原體基因組中保守的編碼域序列進行 PCR 檢測的方法來進行支原體檢測的。


      除此之外還有相差顯微鏡法和電鏡掃描法,不過,因其限制因素較大,在此不進行說明。
zui后,單獨使用目前市場上任何一種支原體檢測試劑盒,都無法做到 準確。嚴格的支原體檢測,應至少使用二種及以上檢驗方法來確定檢驗準確性。

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