構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上，載體被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞并整合到宿主染色體中，用載體中所含抗性基因進(jìn)行篩選，可得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白、或者穩(wěn)定表達(dá)沉默特定基因的細(xì)胞株，即穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株主要有兩種方法：線性質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法和慢病毒感染法。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染受制于質(zhì)粒大小、轉(zhuǎn)染介質(zhì)的限制，對(duì)很多細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低，而且質(zhì)粒整合入細(xì)胞基因組的效率極低，所以構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株的成功率不高。而慢病毒幾乎可以感染所有種類的細(xì)胞，并且在感染后容易整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)行長時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)，因此，慢病毒是目前用于構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株zui主流的方法。





構(gòu)建流程以及注意事項(xiàng)

1. 慢病毒載體構(gòu)建，過表達(dá)載體或者干擾載體構(gòu)建

慢病毒過表達(dá)載體有基因容量限制，對(duì)于大于5k的基因，包裝出慢病毒的概率很低，不建議包裝病毒。同時(shí)大于3k的目的基因也可能有不出毒或者出毒量低，在做正式實(shí)驗(yàn)之前，可用先-進(jìn)行病毒的小量包裝，成功后再進(jìn)行病毒大量包裝。對(duì)于敲低，通常的策略是對(duì)一個(gè)基因同時(shí)選擇3個(gè)干擾靶點(diǎn)，通過qPCR驗(yàn)證干擾效率之后，使用效率好的靶點(diǎn)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

慢病毒載體帶有不同的標(biāo)簽，如果研究細(xì)胞定位，可以選擇帶熒光標(biāo)簽的慢病毒載體，比如帶GFP/RFP等；如果準(zhǔn)備篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，可以選擇帶篩選標(biāo)簽的慢病毒載體，比如puro/neo等載體；如果目的基因大小適中，也可以選擇同時(shí)帶熒光標(biāo)簽和篩選標(biāo)簽的載體。

2. 293T細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒包裝

細(xì)胞的狀態(tài)對(duì)于病毒包裝有很大的影響，如果細(xì)胞狀態(tài)不好可能不出毒或者出毒量很低。取狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長期的293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝。第三代四質(zhì)粒包裝質(zhì)粒配比，可以按照分子量來折算，并在附近量做實(shí)驗(yàn)，摸索zui適質(zhì)粒配比，以得到geng高滴度的病毒。

3. 慢病毒滴度檢測及保存，使用熒光梯度稀釋法或者qPCR法檢測

慢病毒表達(dá)時(shí)間較慢，熒光表達(dá)所需時(shí)間較長，建議感染后72小時(shí)后觀測熒光表達(dá)或者qPCR檢測。感染期間請(qǐng)根據(jù)細(xì)胞生長的情況對(duì)細(xì)胞進(jìn)行及時(shí)換液，以保證細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。值得考慮的是使用低濃度的血清來培養(yǎng)細(xì)胞，作用是抑制細(xì)胞增殖。

特別注意，慢病毒可以存放于-80℃6個(gè)月以上，但如果病毒儲(chǔ)存時(shí)間超過6個(gè)月，建議在使用前重新滴定病毒滴度。反復(fù)凍融會(huì)降低病毒滴度，每次凍融會(huì)降低病毒滴度10%，因此，在病毒使用過程中應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融，強(qiáng)烈建議收到病毒后按照每次的使用量將病毒進(jìn)行分裝。

4. 目的細(xì)胞MOI值摸索，確定zui適慢病毒感染復(fù)數(shù)

同一種細(xì)胞在不同實(shí)驗(yàn)室中由于傳代次數(shù)、操作細(xì)節(jié)的不同，細(xì)胞狀態(tài)會(huì)有所差異，另一方面病毒液在運(yùn)輸、保存過程中可能造成即時(shí)滴度的變化。因此為了達(dá)到zui-佳的實(shí)驗(yàn)效果，建議在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行3-4種不同MOI的感染預(yù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞匯合度對(duì)抗生素篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時(shí)細(xì)胞匯合度不宜超過50%。

5. 目的細(xì)胞藥物篩選濃度確定-通過梯度實(shí)驗(yàn)

使用不同濃度的抗生素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，選擇出在10-14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的zui-低抗生素濃度來進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。不同的細(xì)胞對(duì)于同一種抗生素，其篩選濃度不同，而同一種細(xì)胞對(duì)于不同的抗生素，其zui-佳使用濃度也不同。所以在進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選之前，一定要先-進(jìn)行藥物濃度篩選預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定zui-佳藥物篩選濃度。

6. 慢病毒感染目的細(xì)胞篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株

由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)，所以篩選不能太早，但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時(shí)間長了就會(huì)被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒，zui終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆。一般在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后才開始加抗生素記性篩選。加藥篩選后，死亡的細(xì)胞會(huì)裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有抗生素表達(dá)的陽性細(xì)胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時(shí)換液。

7. 穩(wěn)轉(zhuǎn)株檢測

通過qPCR或者Western Blot檢測目的基因，需要注意的是，mRNA的表達(dá)水平可能和蛋白的表達(dá)水平不一致，如果需要進(jìn)一步研究蛋白的功能，可以使用WB檢測蛋白的表達(dá)水平。

一般需要構(gòu)建穩(wěn)定株的情況如下：

1. 長期在目的細(xì)胞中研究基因功能，通過構(gòu)建穩(wěn)定株，可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本，也極-大方便實(shí)驗(yàn)研究；

2. 部分蛋白半衰期極長，瞬時(shí) RNA 只能干擾表達(dá)，無法去除已經(jīng)表達(dá)的目的蛋白，通過構(gòu)建穩(wěn)定株可以實(shí)現(xiàn)geng好的基因干擾效果；

3. 瞬轉(zhuǎn)往往會(huì)引入極高拷貝數(shù)的表達(dá)，導(dǎo)致因?yàn)槿藶橐蛩卦斐蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果的不精-確，構(gòu)建穩(wěn)定株可以幫助篩選拷貝數(shù)適量的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；

4. 需要用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的，主要是一些致死基因或者是需要時(shí)空表達(dá)的；

5. 需要用細(xì)胞做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的，比如裸鼠成瘤等，往往需要構(gòu)建成穩(wěn)轉(zhuǎn)