轉(zhuǎn)染可謂是做生物學(xué)實(shí)驗的大家經(jīng)常會考慮的一項實(shí)驗技術(shù)，大致原理也都是明白的。到底轉(zhuǎn)染是什么呢，為什么轉(zhuǎn)染效率不高呢，今天我們就來一起討論一下其中奧妙吧。

  轉(zhuǎn)染，就是在真核細(xì)胞里導(dǎo)入具有生物功能的核酸，并在細(xì)胞中維持其生物功能。

  轉(zhuǎn)染方法的選擇

  我們熟知且常用的轉(zhuǎn)染方法主要有物理介導(dǎo)，化學(xué)介導(dǎo)，生物介導(dǎo)。但實(shí)驗室使用較多的主要有化學(xué)介導(dǎo)中的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（質(zhì)粒轉(zhuǎn)染）和生物介導(dǎo)中的慢病毒轉(zhuǎn)染法。其中質(zhì)粒轉(zhuǎn)染操作簡單，一般瞬時轉(zhuǎn)染選擇較多，但有些細(xì)胞系不容易轉(zhuǎn)染，因此選擇轉(zhuǎn)染方式時一定要做足功課，親身經(jīng)歷告訴我，千萬不要圖方便，否則轉(zhuǎn)染效率簡直崩潰。特別是養(yǎng)原代細(xì)胞的小伙伴，一點(diǎn)要認(rèn)真選擇！病毒轉(zhuǎn)染一般具有能夠穩(wěn)定表達(dá)的優(yōu)勢，且其對原代細(xì)胞有較高的轉(zhuǎn)染效率，其中分為慢病毒轉(zhuǎn)染，逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染和腺病毒轉(zhuǎn)染，其中腺病毒轉(zhuǎn)染可適合為難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，例如懸浮細(xì)胞、T細(xì)胞、raw細(xì)胞等難轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

  轉(zhuǎn)染技術(shù)的注意事項

  1、細(xì)胞狀態(tài)

  眾suo周知，細(xì)胞的生長狀態(tài)影響實(shí)驗結(jié)果，原代細(xì)胞和傳代次數(shù)多的細(xì)胞都不是佳選擇，處于對數(shù)生長期的細(xì)胞生長狀態(tài)好，shi合轉(zhuǎn)染。同時，我們都知道細(xì)胞的密度不宜過大，大家往往注意的都是轉(zhuǎn)染前的密度，失敗過很多次的經(jīng)歷告訴大家，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞密度加重要。有時候轉(zhuǎn)染時間太久，等到進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗時細(xì)胞已經(jīng)肆意生長，漂起來了，豈不前功盡棄，流著眼淚也要告訴大家，考慮好細(xì)胞的生長周期和轉(zhuǎn)染的時間進(jìn)行鋪板，建議選擇50%~80%區(qū)間密度進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

  2、實(shí)驗污染

  跟細(xì)胞有關(guān)的實(shí)驗當(dāng)然要注意不能污染啦，細(xì)菌，真菌，支原體都是應(yīng)該嚴(yán)格注意的，不僅會浪費(fèi)試劑，也會影響實(shí)驗結(jié)果。(注：支原體污染不易觀察到，轉(zhuǎn)染前可用環(huán)丙沙星處理避免污染)

  3、轉(zhuǎn)染試劑的處理

  質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：1. 質(zhì)粒的純度會影響轉(zhuǎn)染的效率，如果質(zhì)粒不純，其含有少量的鹽，蛋白會嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)染復(fù)合體的形成，因為內(nèi)毒素嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)染效率，還需進(jìn)行質(zhì)粒內(nèi)毒素的處理。

  2. 其次如選用lipo2000或lipo3000，需注意嚴(yán)格按照說明書的加樣順序添加，其中mix well只需用槍輕輕混勻或手指輕輕晃動，切忌用力吹打，會導(dǎo)致脂質(zhì)體失去作用。

  3. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時需用無血清的Opti-MEM Medium，關(guān)于是否嚴(yán)格控制雙抗，hao咨詢一下轉(zhuǎn)染試劑廠家技術(shù)，本實(shí)驗室用的lipo3000咨詢過技術(shù)支持，說使用雙抗并不影響轉(zhuǎn)染效率，害怕污染的小伙伴們可以放心使用啦。

  穩(wěn)轉(zhuǎn)株的篩選

  根據(jù)不同的實(shí)驗需求，如需進(jìn)行劃痕，transwell等培養(yǎng)時間較長的實(shí)驗，好使用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，而我的實(shí)驗后收細(xì)胞只需檢測相應(yīng)蛋白的表達(dá)不用較長時間培養(yǎng)，選擇瞬轉(zhuǎn)即可。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染一般是瞬時轉(zhuǎn)染，如需篩選穩(wěn)定株需要在藥物的作用下，因常用質(zhì)粒載體pcDNA3.1，其含有neomycin的基因，可選擇G418進(jìn)行篩選，根據(jù)教程需要提前對不同濃度的G418進(jìn)行細(xì)胞篩選，選擇適篩選濃度，提供一個小tip！可以通過閱讀文獻(xiàn)，選擇一定的濃度區(qū)間大梯度進(jìn)行篩選，在全部存活和死亡較多的兩個濃度間再設(shè)定濃度梯度進(jìn)行篩選，這樣得出的篩選濃度為準(zhǔn)確。同時由于基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)需要一定時間才能夠表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)，但如果轉(zhuǎn)染時間較長，細(xì)胞代謝時間較久，轉(zhuǎn)染細(xì)胞也會逐漸減少，因此要合理控制進(jìn)行篩選的時間。注意：藥物篩選時細(xì)胞密度不要太低，否則密度太低全部篩死就可以快樂地進(jìn)行下一次實(shí)驗了。

  轉(zhuǎn)染效率的驗證

  1、有效的驗證方式必須是qPCR驗證

  2、熒光觀察，使用病毒轉(zhuǎn)染，明白自己病毒的情況，是熒光標(biāo)記（一般是GFP）還是非熒光標(biāo)記。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，可以在載體上添加熒光標(biāo)記，幫助自己通過熒光觀察轉(zhuǎn)染效率。但是熒光并不能完全證明轉(zhuǎn)染效率，還是通過核酸驗證為準(zhǔn)確。