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古朵帶您了解,蛋白含量測定方法-Bradford法

發(fā)布時間:2022-11-13瀏覽次數(shù):954返回列表

  古朵帶您了解,蛋白含量測定方法-Bradford法


  蛋白含量測定方法-Bradford法(考馬斯亮藍(lán)法)

  原理:這一方法基于考馬斯亮藍(lán)G-250有紅藍(lán)兩種不同的形式。在一定濃度的乙醇及酸性條件下,可配成淡紅色的溶液,當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后,產(chǎn)生藍(lán)色化合物,反應(yīng)迅速而穩(wěn)定。反應(yīng)化合物在465-595nm處有zui大的光吸收值,化合物顏色的深淺與蛋白濃度的高低成正比關(guān)系,因此可檢測595nm的光吸收值的大小計算蛋白的含量。

  試劑:

  (1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液,牛血清清蛋白(BSA),配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。

  (2)考馬斯亮蘭G―250染料試劑:稱100mg考馬斯亮蘭G―250,溶于50ml 95%的乙醇后,再加入120ml 85%的磷酸,用水稀釋至1升。

  實(shí)驗(yàn)方法:

  (1)取16支試管,1支作空白,3支留作未知樣品,其余試管分為兩組按表中順序,分別加入樣品、水和試劑,即用1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml,然后用無離子水補(bǔ)充到0.1ml。zui后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭G―250試劑,每加完一管,立即在旋渦混合器上混合(注意不要太劇烈,以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除)。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。

  (2)加完試劑2~5分鐘后,即可開始用比色皿,在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595,空白對照為第1號試管,即0.1mlH2O加5.0mlG―250試劑。

  注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色),可用塑料或玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗,以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡。

  (3)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量(mg)為橫座標(biāo),用吸光度值A(chǔ)595為縱座標(biāo),作圖,即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)測出的未知樣品的A595值,即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。

    0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.50。

  特點(diǎn):

  (1)靈敏度高,其zui低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大,蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有高的消光系數(shù),因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大得多。

  (2)測定快速、簡便,只需加一種試劑。完成一個樣品的測定,只需要5min左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程大約只要2min即可完成,其顏色可以在1h內(nèi)保持穩(wěn)定,且在5min~20min之間,顏色的穩(wěn)定性,因而*不用像Lowry法那樣費(fèi)時和嚴(yán)格地控制時間。

  (3)干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子,Tris緩沖液,蔗糖,甘油,巰基乙醇,EDTA等均不干擾此測定法。

  蛋白含量測定方法-Bradford法 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品,勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司,產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個國家和地區(qū),我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求”的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場需求為導(dǎo)向,不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品,提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量”的方針