操作elisa檢測(cè)試劑盒需掌握的知識(shí)點(diǎn)

  elisa檢測(cè)試劑盒的正確操作非常重要。以下是操作elisa檢測(cè)試劑盒之前須掌握的一些要點(diǎn)，希望對(duì)于剛剛進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的新手能夠有所幫助。

  樣本的準(zhǔn)備：盡量使用新鮮樣本，不使用有溶血，被細(xì)菌污染、標(biāo)本保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)和標(biāo)本凝固不全的樣本。ELISA檢測(cè)宜采集新鮮標(biāo)本，如不能立即測(cè)定，5天之內(nèi)應(yīng)4℃保存，對(duì)于1周后檢測(cè)的樣本應(yīng)低溫凍存;做好分裝，長(zhǎng)時(shí)間凍存的樣本避免反復(fù)凍融。

  仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)，熟悉整個(gè)流程，推薦畫(huà)出簡(jiǎn)要步驟圖;提前準(zhǔn)備試劑，比如常見(jiàn)20X洗滌液是濃縮液，需要用超純水提前稀釋準(zhǔn)備好。一般的檢測(cè)抗體和酶標(biāo)二抗需要用對(duì)應(yīng)的稀釋液稀釋至工作濃度。

  不同批次的試劑不要混用，檢查各組分的有效期。

  預(yù)包被的酶標(biāo)板條和各試劑組份需要室溫平衡30 min以上，這樣做的目的能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度較快地達(dá)到所需溫度，預(yù)防后續(xù)實(shí)驗(yàn)中由于孵育溫度或是時(shí)間不夠充分，而將一些弱陽(yáng)性樣本不能檢出。

  待測(cè)樣本加樣：待檢樣本過(guò)多時(shí)，建議分批操作;需要稀釋的樣本提前做好稀釋?zhuān)⒁膺x對(duì)合適稀釋液;控制好加樣時(shí)間，避免加樣費(fèi)時(shí)過(guò)長(zhǎng)造成誤差;注意加樣角度，垂直加入孔底，不要接觸孔壁, 做到一份樣本一個(gè)移液頭，防止交叉污染。

  溫育和洗板：溫育時(shí)間和溫度一般根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行選擇。溫育時(shí)可以采用水浴或者濕盒孵育,避免“邊緣效應(yīng)”。①手工洗板時(shí)，拍板時(shí)要垂直，避免交叉污染，用力不能過(guò)猛，防止抗原抗體復(fù)合物脫離;②洗板機(jī)洗板時(shí)應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否通暢。

  顯色：市售elisa檢測(cè)試劑盒，一般是以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物的顯色液，反應(yīng)條件為37℃或室溫反應(yīng)15～30 min。顯色反應(yīng)需要避光。

  讀數(shù)和數(shù)據(jù)分析：終止后讀取結(jié)果盡量在15min內(nèi)完成，讀取OD值時(shí)酶標(biāo)儀需先預(yù)熱15～30 min再進(jìn)行。數(shù)據(jù)分析一般用四參數(shù)和直線擬合法，選擇哪種擬合方式，可以依據(jù)標(biāo)曲的相關(guān)系數(shù)(R2)來(lái)確定，R2一般需要大于0.99。

  ELISA試劑盒避免顯色淡及靈敏度偏低的方法：

  A、盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間，夏季應(yīng)放冰塊降溫。

  B、試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開(kāi)盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫。

  C、注意培養(yǎng)箱溫度，放入反應(yīng)板后盡量減少開(kāi)啟次數(shù)以免影響溫度恒定，非隔水式培養(yǎng)箱尤其應(yīng)注意。

  D、校正定時(shí)鐘準(zhǔn)確定時(shí)。

  E、按說(shuō)明書(shū)要求保留洗滌時(shí)間，準(zhǔn)確記住洗滌次數(shù)。

  F、校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時(shí)要緊密，吸嘴內(nèi)壁要清潔，一次性使用。

  G、使用新鮮合格的蒸餾水。

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