實(shí)驗(yàn)快報(bào)：固體樣本處理方法

  固體樣本處理原則：稱取1g的固體樣本，用9g的合適緩沖液溶解，分泌蛋白可以直接離心取上清檢測(cè)，細(xì)胞內(nèi)的蛋白，要先收集細(xì)胞，再用合適方法破碎，離心取上清測(cè)試。

  1、組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取1g組織，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清。分裝一份待檢測(cè)，其余冷凍備用，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。對(duì)于植物組織，不好勻漿的話，就用液氮研磨，將植物組織放在研缽中，加入適量液氮，充分研磨。

  2、細(xì)胞內(nèi)蛋白樣本：

  許多待測(cè)蛋白不是分泌蛋白，而是存在于細(xì)胞內(nèi)的蛋白，這個(gè)時(shí)候，要先收集細(xì)胞，洗滌干凈，再破碎細(xì)胞，離心取上清。

  (1)培養(yǎng)的細(xì)胞

  A、動(dòng)物細(xì)胞：用PH7.2-7.4的PBS稀釋細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過反復(fù)凍融(如果反復(fù)凍融，破碎效果不好，就采用超聲波破碎)，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

  B、植物細(xì)胞：用PH7.2-7.4的PBS稀釋細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右，置于冰盒上，用超聲破碎儀，設(shè)置破碎2s，冷卻30s的方式，充分破碎細(xì)胞，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

  (2)組織的細(xì)胞

  切割標(biāo)本后，稱取1g組織，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，去除上清，再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗滌沉淀的細(xì)胞三遍。再用上述的細(xì)胞破碎方法破碎細(xì)胞。

  3、土壤：稱取1g土壤，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工將標(biāo)本充分混勻。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清。分裝一份待檢測(cè)，其余冷凍備用，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。如果是測(cè)分泌蛋白，直接取上清檢測(cè)，測(cè)試細(xì)胞內(nèi)蛋白，要破碎細(xì)胞。

  4、咽拭子：加入2g的pH7.2-7.4左右的PBS，溶解咽拭子頭部，搖勻，用鑷子取出咽拭子并擠干液體，2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)，仔細(xì)收集上清。分裝一份待檢測(cè)，其余冷凍備用，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。如果是測(cè)分泌蛋白，直接取上清檢測(cè)，測(cè)試細(xì)胞內(nèi)蛋白，要破碎細(xì)胞。

  5. 植物標(biāo)本的采集及保存

  1、 稱取0.1g(誤差±3%以內(nèi))新鮮植物組織樣本，在液氮中充分研磨;

  2、 加入1ml的提取液(80%甲醇), 置于-20度過夜;

  3、 于4度，8000rpm，離心1小時(shí)，取上清;

  4、 上清液過C-18固相萃取柱。具體步驟是： 80%甲醇(1ml)平衡柱→上樣→收集樣品→移開樣品后用甲醇(5ml)洗柱→(5ml)洗柱→甲醇(5ml)洗柱→循環(huán)。過柱后的樣本真空干燥或氮?dú)獯蹈桑４鎮(zhèn)溆?

  5、 上樣前加入pH7.4 PBS緩沖液(1ml定容)?；靹蚝笫覝胤胖?0分鐘，然后4度離心(8000rpm，15分鐘)，取上清并暫時(shí)保存于4度待用。

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