古朵技術(shù)教您一次學(xué)會免疫熒光抗體的選擇小技巧

  一、根據(jù)樣本選擇一抗：

  一抗選擇需滿足IF應(yīng)用，一抗種屬應(yīng)盡量選擇與檢測樣本不同來源，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

  舉例：檢測小鼠樣本，則盡量避免選擇小鼠或大鼠源的一抗(如果選了同種屬一抗建議加個同型對照)，好選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測分子(熒光素、生物素等)的抗兔IgG。

  二、根據(jù)一抗種屬選擇二抗：

  根據(jù)一抗類型與亞型：如果一抗是IgM，就選擇抗IgM二抗。

  二抗的類型：細胞或組織表達Fc受體較高，全長二抗的Fc端容易與Fc受體結(jié)合，選擇F(ab)2片段抗體避免非特異性結(jié)合。

  二抗的純化方式：經(jīng)交叉吸附處理的二抗在純化后再次通過固定了其他種屬的血清或抗體的純化柱，降低種屬間交叉反應(yīng)，在多色分析具有突出的優(yōu)勢。

  熒光基團：選擇光譜不重疊且穩(wěn)定明亮的熒光基團;顏色搭配時也要適當(dāng)考慮強弱搭配。

  3大技巧：

  對于多色分析，原則上一抗盡量來源于不同種屬，且熒光標(biāo)記二抗與一抗的種屬要匹配，避免二抗發(fā)生交叉反應(yīng);兩種抗體熒光素的光譜重疊效應(yīng)應(yīng)小。

  實驗前好先驗證單標(biāo)對特定組織或細胞是否有效，再進行多標(biāo)實驗。

  如果采用TSA技術(shù)，則不需要考慮一抗種屬來源問題

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