過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定的實(shí)驗(yàn)步驟

  【實(shí)驗(yàn)原理】

  植物體內(nèi)的黃素氧化酶類(lèi)代謝產(chǎn)物常包含H2 02 ，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中 的葡萄糖氧化酶等。H2 02 的積累可導(dǎo)致破壞性的氧化作用。過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)是清除 H2 02 的重要保護(hù)酶，能將H2 02 分解為02 和H2 0, 從而使機(jī)體免受H2 02 的毒害作用。其活性與植物的抗逆性密切相關(guān)。

  (CAT)催化如下反應(yīng)：

  2 H2 02 →2 H2 0 + 02

  本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定H2 02 的減少量來(lái)測(cè)定CAT的活性。

  在H2 02 存在條件下，過(guò)氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色的4-鄰甲氧基苯酚?？捎梅止夤舛扔?jì)測(cè)生成物的含量來(lái)測(cè)定活性。

  【試劑藥品

  1.50m mol/l pH7.0的磷酸緩沖液

  2.0.3% H2 02: 吸0.5ml 30% H2 02 加入pH7.0的磷酸緩沖液至 50ml

  3.0.2% 愈創(chuàng)木酚 :秤0.2g愈創(chuàng)木酚加入pH7.0的磷酸緩沖液至 100ml

  【實(shí)驗(yàn)步驟】

  酶液的制備

  1.稱(chēng)取葉片 0.25g ，加入5倍量的(M/V)pH7.0 的PBS 冰浴研磨 15000r/min

  離心15min取部分上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后用于酶活性測(cè)定。

  2. CAT 活性的測(cè)定

  在3ml的反應(yīng)體系中，包括0.3% H2 02 1ml, H2 0 1.95ml, 后加入0.05ml酶液

  啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定波長(zhǎng)240nm處的OD降低速度。將每分鐘OD減少0.01定義為1個(gè)活力單位。

  3. POD 活性的測(cè)定

  在3ml的反應(yīng)體系中，包括0.3% H2 02 1ml, .0.2% 愈創(chuàng)木酚0.95ml,pH7.0的PBS 1ml，后加入0.05ml酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，記錄470nm處OD增加速度。將每分鐘OD增加0.01定義為1個(gè)活力單位。

  4. 用考馬斯亮藍(lán) G-250法測(cè)定蛋白含量.

  【實(shí)驗(yàn)結(jié)果及計(jì)算】

  CAT和POD的酶活性以U/mg蛋白或U/gFW表示。

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