細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明書

 

  細(xì)胞增殖檢測試劑盒

  原理：EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)，中文名為5-乙h基-2' -脫氧尿苷，是一種胸腺嘧啶核苷類似物，其炔羥基團(tuán)在天然化合物中很少見，在細(xì)胞增殖時(shí)能夠替代胸苷(胸腺嘧啶脫氧核苷，thymidine) 插入正在復(fù)制的DNA分子中， EdU上的乙h基能與熒光標(biāo)記的小分子疊氮化物探針(如Azide Alexa Fluor 488等)通過一價(jià)銅離子催化發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，該反應(yīng)非常迅速，被稱作點(diǎn)擊反應(yīng)(Click reaction)，從而可以進(jìn)行高效快速的檢測細(xì)胞增殖，特別是可以有效地檢測處于S期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

  與傳統(tǒng)的免疫熒光染色(BrdU)檢測方法相比， EdU只有BrdU抗體大小的1/500，在細(xì)胞內(nèi)容易擴(kuò)散，不需要嚴(yán)格的樣品變性(酸解、熱解、酶解)處理，有效地避免了樣品損傷，有助于在組織、器官的整體水平上觀測細(xì)胞增殖的真實(shí)情況，具有高的靈敏度和快的檢測速度。

  規(guī)格：200T

  有效期：12個(gè)月

  試劑盒組成

  貨號Code品名Product name儲存條件Storage condition

  10mL-20℃

  1mL*2-20℃

  400μL-20℃

  色原50μL-20℃

  EdU母液 100μL-20℃

  備注：AC為粉劑，使用之前需要加入1mL純水，充分溶解之后再使用，AC容易氧化失效，不使用時(shí)放入冰箱-20度保存，如發(fā)現(xiàn)變色，需換新鮮試劑。

  實(shí)驗(yàn)流程

  1.樣本處理

  1.1動物實(shí)驗(yàn)

  1.1.1動物EdU注射

  對于小鼠，可以按照10-200mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定濃度，腹腔注射、特定組織或器官局部注射或者加入飲用水中。具體用量跟所用動物的種類、體重和使用方式有關(guān)，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)，因此初次使用時(shí)建議對EdU的使用濃度進(jìn)行一定的摸索，或者直接使用50mg/kg的濃度進(jìn)行測試。

  注射方式:依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)而定，如腹腔注射，皮下注射，肌肉注射，尾靜脈注射等，其中以腹腔注射為多。

  6小時(shí)后或根據(jù)特定實(shí)驗(yàn)確定適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后，快速處死小鼠，取出所需組織，按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片。EdU標(biāo)記的時(shí)候也可參考相關(guān)文獻(xiàn)自行調(diào)整。

  建議任何實(shí)驗(yàn)均可取小腸組織檢測細(xì)胞增殖情況，小腸上皮組織細(xì)胞增殖快，成年小鼠EdU注射6小時(shí)后即可檢測到陽性信息，可用作陽性對照進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。

  1.1.2切片處理

  切片前處理：組織器官好進(jìn)行清洗，以去除血液、組織中殘留的EdU，降低背景。

  切片厚度：3-10μm為宜，切片過厚可能會影響切片背景及染色效率。

  切片后處理：

  石蠟切片脫蠟：二甲b脫蠟2次，15分鐘/次，梯度乙醇(，95%，85%，75%)各一次，5分鐘/次，去離子水洗脫1次。

  冰凍切片處理：室溫放置30分鐘后，固定10分鐘，PBS清洗3次，每次5分鐘。

  1.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

  1.2.1細(xì)胞EdU標(biāo)記

  用細(xì)胞培養(yǎng)基和EdU母液按8000：1的比例稀釋，制備適量50μM的EdU培養(yǎng)基;

  每孔加入適量50μM的EdU培養(yǎng)基孵育2小時(shí)，棄培養(yǎng)基(佳孵育時(shí)間一般為細(xì)胞周期的1/10),EdU培養(yǎng)基和EdU反應(yīng)液孵育體積可參考下表;

  3)PBS清洗細(xì)胞3次，每次5分鐘

  96孔板48孔板24孔板12孔板6孔板5.5cm小皿

  EdU培養(yǎng)基100μL200μL300μL500μL1mL2mL

  EdU反應(yīng)液100μL200μL300μL500μL1mL2mL

  1.2.2細(xì)胞固定通透

  1)每孔加入細(xì)胞固定液(含4%的多聚甲醛的PBS)室溫孵育15分鐘，棄固定液，PBS 清洗3次，每次5 分鐘。;

  2)每孔加入滲透劑(0.5% TritonX-100 的 PBS)脫色搖床孵育 15 分鐘;PBS 清洗3次，每次5 分鐘。

  2.EdU反應(yīng)

  按照PB：CU：AC：647色原=860：40：100：5的比列配制EdU反應(yīng)液(反應(yīng)液現(xiàn)配現(xiàn)用)。

  每個(gè)樣本滴加50-100μL的EdU染色反應(yīng)液(反應(yīng)液均勻覆蓋樣本)，室溫避光孵育15-60分鐘，棄染色反應(yīng)液，PBS沖洗3次，每次5分鐘。

  3.DAPI染色

  每個(gè)樣本加入50-100μL DAPI染色液，染色15分鐘，PBS清洗3次，每次5分鐘。

  4.圖像拍照

  染色完成后建議立刻觀察，使用熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡或者全片掃描儀進(jìn)行采集圖像，染色完玻片避光4℃保存。

 

  以上是50mg/kg標(biāo)記小鼠6小時(shí)的染色圖像

  實(shí)驗(yàn)前須知

  EdU 的分子量為 252.23，易溶于水，PBS，生理鹽水。

  對于動物實(shí)驗(yàn)，建議將EdU粉末溶解于DMSO配制成100mg/ml的母液。

  EdU 建議初始給藥量為 50mg/kg(50μg/g)，稀釋濃度為 0.5~1mg/mL。小鼠體重20g，需要注射1mg，以1mg/mL計(jì)算，需要注射1mL。

  Edu0.1mg1mg2mg10mg

  PBS100μL1mL2mL10mL

  對于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)， EdU母液質(zhì)量濃度為100mg/mL，轉(zhuǎn)化為物質(zhì)的量濃度為400mM，建議將EdU母液稀釋成50mM儲存液，推薦的EdU工作濃度為10μM。

  文章引用試劑盒/方法：Staining of EdU was performed using a EdU cell proliferation Assay kit ( Recordbio Biological Technology, Shanghai, China) based on the click chemistry technology according to the manufacture’s instruction.

  試劑盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個(gè)國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場需求為導(dǎo)向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。