知識(shí)點(diǎn)分享：細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的小細(xì)節(jié)

  細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。

  細(xì)胞復(fù)蘇是一個(gè)簡(jiǎn)單的試驗(yàn)操作，但操作中也有許多需要注意的事項(xiàng)，在實(shí)驗(yàn)操作中注意細(xì)小的問題，才能使復(fù)蘇后的細(xì)胞保持良好的狀態(tài)，針對(duì)細(xì)胞復(fù)蘇應(yīng)該注意以下幾點(diǎn)：

  1. 可以提前把需要的體積的培養(yǎng)液放到培養(yǎng)瓶里，擰松瓶蓋，放到孵箱里30分鐘--1個(gè)小時(shí);

  2. 為防止凍存管在升溫時(shí)出現(xiàn)爆裂等情況，可以在放入水浴前就把超凈臺(tái)里的蓋子擰松一下然后再擰上;

  3. 水浴溫度37℃左右。

  一、凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融

  當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。

  如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生大的冰晶;如果快速冷凍的話，細(xì)胞內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生大的冰晶，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。

  二、慢凍程序

  1. 標(biāo)準(zhǔn)程序：采用細(xì)胞凍存器

  當(dāng)溫度在-25 ℃以上時(shí)，1~2 ℃/min;

  當(dāng)溫度達(dá)-25 ℃以下時(shí)，5~10 ℃/min;

  當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入液氮中。

  2. 簡(jiǎn)易程序：將冷凍管(管口要朝上)放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度，在40 min內(nèi)降至液氮表面過夜，次日早晨投人液氮中。

  3. 傳統(tǒng)程序：冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

  三、低溫保護(hù)劑的應(yīng)用

  在細(xì)胞凍存時(shí)加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。

  常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。

  四、細(xì)胞凍存方法

  1. 預(yù)先配制凍存液

  (1)10%DMSO + 細(xì)胞生長(zhǎng)液(20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液)

  (2)10%甘油+ 細(xì)胞生長(zhǎng)液(20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液)

  2. 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉海?用吸管吹打制成細(xì)胞懸液(1×106 ~ 5 ×106細(xì)胞/ml)。

  3. 加入1 ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。液氮長(zhǎng)期保存。

  五、保存細(xì)胞的復(fù)蘇方法

  1. 快速解凍

  凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在1 分鐘內(nèi)全部融化(不要超過3 分鐘)。

  2. 解凍后的細(xì)胞可直接接種到生長(zhǎng)培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng)，24小時(shí)后再用新鮮培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO。

  3. 如果細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑特別敏感

  解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到生長(zhǎng)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。

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