HL80154.1 v.A

主要用途

石蠟切片軟骨組織II型膠原蛋白免疫組化染色試劑是一種旨在使使用標(biāo)準(zhǔn)化的化學(xué)分離石蠟方法和免疫抗體顯色技術(shù)，即通過(guò)抗II型多克隆抗體以及辣根過(guò)氧化物酶綴合物二抗，使用染料二氨基聯(lián)苯胺染色顯示棕褐色，分析存檔中的石蠟包埋的組織切片中II型膠原蛋白表達(dá)和分布狀況的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。主要適用于石蠟包埋的各種人體、大鼠、猿猴、豬、牛、小鼠、兔、狗、雞、馬等軟骨組織細(xì)胞II型膠原蛋白分析。廣泛用于軟骨細(xì)胞識(shí)別、分化、異常病變的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，顯色清晰，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

膠原蛋白（collagen）是為豐富的蛋白質(zhì)家族，構(gòu)成結(jié)締組織的主要元素，包括皮膚、骨組織、筋腱（tendon）、韌帶（ligament）、心臟等，在炎癥過(guò)程中發(fā)生重要作用。哺乳動(dòng)物組織中有超過(guò)26個(gè)類型膠原蛋白，由3個(gè)α鏈（甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸）組成，構(gòu)建穩(wěn)定且牢固的三重螺旋結(jié)構(gòu)（triple helical structure），抵抗各種壓力，包括蛋白酶降解、熱力、以及各種化學(xué)性和物理性影響。其中I型膠原蛋白為纖維狀（fibrillar）膠原蛋白，由2個(gè)相同的α1鏈和1個(gè)α2鏈組成；而II型膠原蛋白限于無(wú)血管組織，例如軟骨組織、眼睛的玻璃體組織、關(guān)節(jié)透明軟骨（articular hyaline cartilage）等，會(huì)誘發(fā)關(guān)節(jié)炎、眼病和多軟骨炎（polychondritis）等疾病。多聚II型膠原蛋白構(gòu)建成人關(guān)節(jié)軟骨組織的核心纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，占三分之二干重和細(xì)胞外框架。 通過(guò)抗I型膠原蛋白多克隆抗體以及辣根過(guò)氧化物酶綴合物二抗（Peroxidase conjugated antibody）反應(yīng)，進(jìn)而使用染料二氨基聯(lián)苯胺染色顯示II型膠原蛋白軟骨細(xì)胞為棕褐色。

產(chǎn)品內(nèi)容

脫蠟液（Reagent A） 300毫升（自備）

補(bǔ)水液A（Reagent B） 毫升

補(bǔ)水液B（Reagent C） 毫升

補(bǔ)水液C（Reagent D） 毫升

補(bǔ)水液D（Reagent E） 毫升

清理液（Reagent F） 毫升

修復(fù)液（Reagent G） 毫升

封阻液（Reagent H） 毫升

一抗液（Reagent I） 毫升

二抗液（Reagent J） 毫升

顯色液A（Reagent K） 微升

顯色液B（Reagent L） 毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份

保存方式

保存修復(fù)液（Reagent G）、一抗液（Reagent I）、二抗液（Reagent J）和顯色液A（Reagent K）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免反復(fù)凍融，其余的保存在4℃冰箱里；二抗液（Reagent J）和顯色液A（Reagent K），避免光照；有效保證3月

用戶自備

小型染色缸：用于石蠟切片的脫蠟和染色操作

蓋玻片：用于抗體孵育操作

光學(xué)顯微鏡：用于細(xì)胞染色后觀察分析

特別注意

1． 顯色液A（Reagent K）和顯色液B（Reagent L）必須在實(shí)驗(yàn)操作前即刻混勻；混勻后切忌久放不用或儲(chǔ)存后備用；用完扔掉

2． 顯色液A（Reagent K）如果出現(xiàn)沉淀，須過(guò)濾后再用

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 脫蠟處理

1． 取出10片4至10微米厚的待測(cè)石蠟包埋的組織切片（注意：石蠟包埋前，組織切片須用10％甲醛4℃條件下，固定16小時(shí)，此步很重要）

2． （選擇步驟）放進(jìn)80℃烘箱，孵育30分鐘

3． （選擇步驟）室溫下靜置15分鐘

4． 按下表依次放進(jìn)小染色缸里孵育

染色缸	孵育時(shí)間
xx毫升脫蠟液（Reagent A）	15分鐘
xx毫升脫蠟液（Reagent A）	15分鐘
xx毫升脫蠟液（Reagent A）	15分鐘
xx毫升補(bǔ)水液A（Reagent B）	3分鐘
xx毫升補(bǔ)水液B（Reagent C）	3分鐘
xx毫升補(bǔ)水液C（Reagent D）	3分鐘
xx毫升補(bǔ)水液D（Reagent E）	3分鐘

5． 小心移去切片上的補(bǔ)水液D（Reagent E）

6． 小心加上xx微升清理液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面

7． 室溫下孵育5分鐘

小心移去切片上的清理液（Reagent F）

二、樣本修復(fù)處理

1． 小心加上xx微升修復(fù)液（Reagent G），鋪滿整個(gè)切片樣品表面

2． 室溫下孵育5分鐘

3． 小心移去切片上的修復(fù)液（Reagent G）

4． 室溫下，將切片置入xx毫升清理液（Reagent F）中孵育5分鐘

5． 小心移去切片上的清理液（Reagent F）

6． 小心加上xx微升封阻液（Reagent H），鋪滿整個(gè)切片樣品表面

7． 室溫下孵育30分鐘

8． 小心移去切片上的封阻液（Reagent H）

9． 室溫下，將切片置入xx毫升清理液（Reagent F）中孵育5分鐘

10． 小心移去切片上的清理液（Reagent F）

三、 免疫標(biāo)記處理

1． 小心加上xx微升含有一抗液（Reagent I），鋪滿整個(gè)切片樣品表面

2． 室溫下，孵育1小時(shí)，保持濕潤(rùn)，避免干燥（注意：可以使用蓋玻片蓋上孵育）

3． 小心移去切片上的一抗液（Reagent I）

4． 室溫下，小心將切片置入xx毫升清理液（Reagent F）中孵育2分鐘

5． 小心移去切片上的清理液（Reagent F）

四、樣本染色處理

在染色前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的顯色液A（Reagent K）置入冰槽里融化，然后移取xx微升顯色液A（Reagent K）和xx毫升顯色液B（Reagent L）到2毫升離心管，充分混勻，標(biāo)記為顯色工作液，置于暗室。然后進(jìn)行下列操作：

1． 小心加上xx微升二抗液（Reagent J）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面（注意：可以使用蓋玻片蓋上孵育）

2． 室溫下孵育30分鐘，避免光照

3． 小心移去切片上的二抗液（Reagent J）

4． 室溫下，小心將切片置入5xx0毫升清理液（Reagent F）中孵育2分鐘

5． 小心移去切片上的清理液（Reagent F）

6． 小心加上xx微升含有顯色液A（Reagent K）和顯色液B（Reagent L）的顯色工作液，鋪滿整個(gè)切片樣品表面

7． 室溫下孵育5至30分鐘，或直至樣本出現(xiàn)棕褐色

8． 小心移去切片上含有顯色液A（Reagent K）和顯色液B（Reagent L）的顯色工作液

9． 室溫下，小心將切片置入xx毫升清理液（Reagent F）中浸泡5秒

10． 小心移去切片上的清理液（Reagent F）

11． （選擇步驟）進(jìn)行甲基綠或蘇木素復(fù)染（注意：建議使用甲基綠復(fù)染試劑盒－40010）

12． 放上蓋玻片或封片

13． 即刻在一般光學(xué)顯微鏡下觀察：陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)棕褐色

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為10次操作

2． 操作時(shí)須戴手套，以防污染

3． 脫蠟液（Reagent A）可以使用二甲苯替代

4． 清理液（Reagent F）50毫升置于小型染色缸里，可重復(fù)使用

5． 所有操作在室溫下進(jìn)行

6． 每次換試劑溶液時(shí)，保持切片面基本晾干。空氣中晾干狀態(tài)為沒(méi)有水滴，呈濕潤(rùn)狀態(tài)，可見(jiàn)反光

7． 試劑溶液在切片表面時(shí)，避免有氣泡存在，同時(shí)確保鋪滿切片表面

8． 細(xì)胞顯色，避免過(guò)度，密切目測(cè)觀察，控制時(shí)間

9． 細(xì)胞顯色完成后，即刻進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察

10． 染色參考圖像如下

11． 本公司提供系列軟組織檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定顯色清晰