第三節(jié) 細胞的凍存與復(fù)蘇

為了防止因污染或技術(shù)原因使長期培養(yǎng)功虧一簣，考慮到培養(yǎng)細胞因傳代而遲早會出現(xiàn)變異，有時因寄贈、交換和購買，培養(yǎng)細胞從一個實驗室轉(zhuǎn)運到另一個實驗室，佳的策略是進行低溫保存。這對于維持一些特殊細胞株的遺傳特性為重要?，F(xiàn)簡要介紹深低溫保存法(－70℃~－196℃)的特點。細胞深低溫保存的基本原理是：在－70℃以下時，細胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于完全停止狀態(tài)，故可以長期保存。細胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi)，水晶呈針狀，易招致細胞的嚴重損傷。

一、細胞的凍存：為避免污染造成的損失，小化連續(xù)細胞系的遺傳改變和避免有限細胞系的老化和轉(zhuǎn)化，需要凍存哺乳細胞。凍存細胞前，細胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染。

有幾種普通培養(yǎng)基用來凍存細胞。對于包含有血清的培養(yǎng)基，成分可能如下：

包含10％甘油的完全培養(yǎng)基，

包含10％二甲基亞砜（DMSO）的完全培養(yǎng)基，

50％ 細胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％甘油的新鮮培養(yǎng)基，或

50％ 細胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。

對于無血清培養(yǎng)基，一些普通的培養(yǎng)基成分可能是：

50％ 細胞條件無血清培養(yǎng)基和50％包含有7.5％二甲基亞砜的新鮮的無血清培養(yǎng)基，或

包含有7.5％二甲基亞砜和10％細胞培養(yǎng)級BSA的新鮮無血清培養(yǎng)基。素爾kasumi-2細胞

1、懸浮細胞

計數(shù)將要凍存的活細胞。細胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期。以大約200～400g離心5分鐘沉淀細胞，使用移液管移去上清到小體積，不要攪亂細胞。

以1×10⁷到5×10⁷細胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細胞，或者以0.5×10⁷到1×10²⁷在無血清培養(yǎng)基中，再次懸浮細胞。

分裝進凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。

細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。

2、貼壁細胞

使用分離試劑從基層分離細胞，分離時盡可能溫和，使對細胞的損傷減少到小。

在完全生長培養(yǎng)基中，再次懸浮分離細胞，確定有活力細胞數(shù)。

以大約200g離心5分鐘沉淀細胞。使用移液管移去上清到小體積，不要攪亂細胞。

以5×10⁶到1×10⁶細胞/ml密度，在凍存液中懸浮細胞。

分裝進凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。

細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。

二、凍存細胞的復(fù)蘇:凍存細胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細胞要快速融化，并直接加入完全生長培養(yǎng)基中。若細胞對凍存劑（DMSO或甘油）敏感，離心去除凍存培養(yǎng)基，然后加入完全生長培養(yǎng)基中。

1、直接鋪板方法

取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化。

直接用完全生長培養(yǎng)基鋪板細胞。1ml凍存細胞使用10~20ml完全生長培養(yǎng)基。進行活細胞計數(shù)，細胞接種應(yīng)該至少在3×10⁵活細胞/ml。培養(yǎng)細胞12到24小時，更換新鮮的完全生長培養(yǎng)基，去除凍存劑。

2、離心方法

取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化。

把1到2ml凍存細胞加入到大約25ml完全生長培養(yǎng)基，輕輕混勻。

以大約80 g離心2到3分鐘。

棄去上清。

在完全生長培養(yǎng)基輕輕再次懸浮細胞，并且進行活細胞計數(shù)。

細胞鋪板，細胞接種應(yīng)該至少為3×105活細胞/ml。

三、細胞的分化、衰老與死亡

1、細胞的分化:一個成年人全身細胞總數(shù)約1012個，可以區(qū)分為200多種不同類型的細胞：形態(tài)結(jié)構(gòu)，代謝，行為，功能等各不相同。追根溯源，這么多種細胞均來自一個受精卵細胞。所以，通常把發(fā)育過程中，細胞后代在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生差異的過程稱為細胞分化。細胞分化發(fā)生在胚胎階段，也發(fā)生在胎兒出生以后，乃至成人階段。例如，人體血細胞的產(chǎn)生和分化，這個過程在人的一生中一直持續(xù)著。

由旺盛生長不斷分裂的細胞，轉(zhuǎn)入分化，通常從細胞周期中G1期開始時一個確定的點G0點“逃逸”出細胞周期。旺盛生長分裂的細胞和各種分化了的細胞，它們的基因表達和代謝活動各不相同。

2、細胞的衰老:體外細胞培養(yǎng)實驗證明：

成纖維細胞：來自胎兒傳代50次后衰老死亡,來自成人傳代20次后衰老死亡(與具體年齡有關(guān));來自小鼠傳代14--28次后衰老死亡,來自烏龜傳代90--125次后衰老死亡。

細胞衰老過程中會發(fā)生一系列的變化，包括：蛋白質(zhì)合成速度降低，已有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，特異蛋白質(zhì)成份出現(xiàn)；同時，細胞核，線粒體，膜系統(tǒng)、骨架系統(tǒng)等都有結(jié)構(gòu)、功能的改變。

細胞衰老原因，尚無定論，出現(xiàn)過好幾種理論與假說，其中得到較廣泛認可的是“自由基損傷假說”。

3、細胞凋亡:細胞的死亡是個體存活的正?，F(xiàn)象，常見的細胞死亡形式有3種：壞死、凋亡和細胞毒性。多細胞生物的生命活動中，因為環(huán)境因素的突然變化或病原物的入侵，導(dǎo)致一部分細胞死去，稱為細胞的病理死亡，或細胞壞死。壞死是細胞暴露于嚴重的物理或化學(xué)刺激時導(dǎo)致的細胞死亡；細胞毒性是由細胞或者化學(xué)物質(zhì)引起的單純的細胞殺傷事件，不依賴于其它兩種細胞死亡機理，如殺傷T細胞的細胞毒性作用。素爾kasumi-2細胞

Acc-3細胞，人涎腺腺樣囊性癌細胞

A2 細胞，人腺樣囊性癌細胞

AM 細胞，人腺樣囊性癌（高轉(zhuǎn)移）細胞

HIC細胞，人小腸癌細胞

DMS153細胞，人小肺癌細胞

H128*細胞，人小肺癌細胞

H358細胞，人小肺癌細胞

H520細胞，人小肺癌細胞

H69細胞，人小肺癌細胞

HS77細胞，人小肺癌細胞

NCI-H209細胞，人小肺癌細胞

NCI-H2227細胞，人小肺癌細胞

NCI-H446細胞，人小肺癌細胞

SMC-1細胞，人胸膜瘤細胞

143TK 細胞，人胸腺激酶缺陷性系細胞

TF-1細胞，人血液白血病細胞

FaDu細胞，人咽鱗癌細胞

CCL-138 細胞，人咽頭癌胸水轉(zhuǎn)移細胞

Detroit 562細胞，人咽頭癌胸水轉(zhuǎn)移細胞

 VUP 細胞，人眼脈洛膜惡性黑色素瘤細胞

OM431細胞，人眼脈洛膜惡性黑色素瘤細胞

SP 6.5細胞，人眼脈洛膜黑色素瘤細胞

C918細胞，人眼脈絡(luò)黑色素瘤細胞

capan-2細胞，人胰腺癌細胞

CFPAC-1細胞，人胰腺癌細胞

MiaCaPa-2細胞，人胰腺癌細胞

PANC-1細胞，人胰腺癌細胞

PATU8988 細胞，人胰腺癌細胞

PC-2細胞，人胰腺癌細胞

SW 1990細胞，人胰腺癌細胞

BxPC-3細胞，人胰腺腺癌細胞

HPAC細胞，人胰腺腺泡上皮癌細胞

HaCaT細胞，人永生化表皮細胞

HL-60*細胞，人原髓白血病細胞

HL-60細胞，人早幼粒急性白血病細胞

CNE1-lmp1細胞，人轉(zhuǎn)lmp1基因鼻咽癌細胞

F2-2細胞，人轉(zhuǎn)基因鼻咽癌系細胞

AsPC-1細胞，人轉(zhuǎn)移胰腺腺癌細胞

C-33 A細胞，人子宮頸癌細胞

ME-180細胞，人子宮頸表皮癌細胞

MS751細胞，人子宮頸表皮癌細胞

SiHa細胞，人子宮頸鱗癌細胞

還有一種情況，一部分細胞的死亡是生物個體正

常生命活動（代謝、生長、發(fā)育、分化）的一個必要部分；似乎帶有“犧牲局部，保全整體”的意味。這種情況下的細胞死亡，明顯地受遺傳控制，稱為細胞凋亡。 凋亡（Apoptosis）則是程序性的、正常的細胞死亡，是機體清除無用的或者不想要的細胞的手段。它與細胞壞死是兩個截然不同的過程，無論從形態(tài)學(xué)、生物學(xué)還是生化的特征來說，都有明顯的區(qū)別。細胞凋亡現(xiàn)象普遍存在于生物界。細胞凋亡與細胞增殖、分化和衰老起著互補與平衡的作用，在多細胞動物的發(fā)育、形態(tài)建成與維持中扮演至關(guān)重要的角色。作為細胞的一種基本生命現(xiàn)象，凋亡失控的結(jié)果將是可怕的：凋亡不足時，易發(fā)生癌變、病毒性疾病和自身免疫疾?。欢蛲鲞^量則可能產(chǎn)生獲得性免疫缺陷綜合征（HIV）、重癥肝炎與退行性神經(jīng)疾病，如老年性癡呆癥（Alzheimer's disease）、帕金森氏癥（Parkinson's disease）。因此研究細胞凋亡及其機理具有重要的理論和實踐意義。

細胞凋亡與壞死的區(qū)別

壞死 ：

形態(tài)學(xué)特征-膜完整性喪失，胞漿和線粒體膨脹，全細胞裂解。

生化特征-離子內(nèi)環(huán)境失調(diào)：非能量依賴性的（被動過程，在4°C也可以發(fā)生），隨機消化DNA（電泳顯示為DNA彌散狀態(tài)），Postlytic DNA斷裂。

生理學(xué)特征-影響群組細胞：由非生理學(xué)因素引起（如補體攻擊、代謝中毒、缺氧等），被巨噬細胞吞噬，周圍有明顯的炎癥反應(yīng)。

凋亡 ：

形態(tài)學(xué)特征-胞膜出芽，但保持完整，染色體聚集在核膜周邊，胞漿收縮、細胞核凝集，后細胞分裂為凋亡小體，Bcl-2家族蛋白導(dǎo)致線粒體膜通透性增加。

生化特征--ATP依賴性的（主動過程，在4°C不能發(fā)生），以核小體為單位剪切DNA（電泳顯示為DNA ladder），Prelytic DNA 斷裂,線粒體釋放多種因子至胞漿中（細胞色素c、AIF），Caspases級聯(lián)活化，膜對稱性改變（PS外翻）

生理學(xué)特征--只影響單個細胞，由生理學(xué)刺激誘導(dǎo)（如生長因子缺乏、激素環(huán)境改變等），被臨近細胞和巨噬細胞吞噬，無炎癥反應(yīng)。素爾kasumi-2細胞