人惡性黑色素瘤細胞

素爾細胞庫提供遺傳變異細胞系、正常組織來源細胞系、腫瘤細胞系、工程細胞系、干細胞系，涉及人類，大鼠、小鼠、鳥類、倉鼠、魚類、貓類、狗、牛、貂、豬、恒河猴、長鼻袋鼠等。

開學(xué)季，買SUER細胞庫細胞，更多好禮相送，買的超值，買的舒心 訂購熱線：人惡性黑色素瘤細胞

大規(guī)模培養(yǎng)常用方法

根據(jù)動物細胞的類型，可采用貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)等三種培養(yǎng)方法進行大規(guī)模培養(yǎng)。

一、動物細胞生長特性及培養(yǎng)溫度

1、細胞生長緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素

2、細胞大，無細胞壁，機械強度低，環(huán)境適應(yīng)性差

3、需氧少，不耐受強力通風(fēng)與攪拌

4、群體生長效應(yīng)，貼壁生長（錨地依賴性）

5、培養(yǎng)過程產(chǎn)品分布細胞內(nèi)外，成本高

6、原代培養(yǎng)細胞一般繁殖50代即退化死亡

依據(jù)在體外培養(yǎng)時對生長基質(zhì)依賴性差異，動物細胞可分為兩類：

貼壁依賴型細胞：需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面才能生長，大多數(shù)動物細胞，包括非淋巴組織細胞和許多異倍體細胞均屬于這一類。

非貼壁依賴型細胞：無需附著于固相表面即可生長，包括血液、淋巴組織細胞、許多腫瘤細胞及某些轉(zhuǎn)化細胞。人惡性黑色素瘤細胞

培養(yǎng)細胞的適溫度相當(dāng)于各種細胞或組織取材機體的正常溫度。人和哺乳動物細胞培養(yǎng)的適溫度為35~37℃。偏離這一溫度，細胞正常的代謝和生長將會受到影響，甚至死亡?？偟膩碚f，培養(yǎng)細胞對低溫的耐力比高溫高。溫度不超過39℃時，細胞代謝強度與溫度成正比；細胞培養(yǎng)置于39~40℃環(huán)境中1h，即受到一定損傷，但仍能恢復(fù)；當(dāng)溫度達43℃以上時，許多細胞將死亡。當(dāng)溫度下降到30~20℃時，細胞代謝降低，因而與培養(yǎng)基之間物質(zhì)交換減少。先看到的是細胞形態(tài)學(xué)的改變以及細胞從基質(zhì)上脫落下來。當(dāng)培養(yǎng)物恢復(fù)到初始的培養(yǎng)溫度時，它們原有的形態(tài)和代謝也隨之恢復(fù)到原有水平。

二、貼壁培養(yǎng)（attachment culture）是指細胞貼附在一定的固相表面進行的培養(yǎng)。

1、生長特性：貼壁依賴型細胞在培養(yǎng)時要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進入對數(shù)生長期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細胞單層。

2、貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點：

容易更換培養(yǎng)液；細胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。

容易采用灌注培養(yǎng)，從而達到提高細胞密度的目的；因細胞固定表面，不需過濾系統(tǒng)。

當(dāng)細胞貼壁于生長基質(zhì)時，很多細胞將更有效的表達一種產(chǎn)品。

同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液/細胞的比例。

適用于所有類型細胞。

3、貼壁培養(yǎng)的缺點：與懸浮培養(yǎng)法相比

擴大培養(yǎng)比較困難，投資大；

占地面積大；

不能有效監(jiān)測細胞的生長；

4、細胞貼壁的表面：要求具有凈陽電荷和高度表面活性。對微載體而言還要求具一定電荷密度；若為有機物表面，必須具有親水性，并帶陽電荷。

5、貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)：主要有轉(zhuǎn)瓶、中空纖維（后面專題介紹）、玻璃珠、微載體系統(tǒng)（后面介紹）等。

轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)：培養(yǎng)貼壁依賴型細胞初采用轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)一般用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過渡階段，或作為生物反應(yīng)器接種細胞準(zhǔn)備的一條途徑。細胞接種在旋轉(zhuǎn)的圓筒形培養(yǎng)器-轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)瓶不斷旋轉(zhuǎn)，使細胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣，從而提供較好的傳質(zhì)和傳熱條件。

轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)具有結(jié)構(gòu)簡單，投資少，技術(shù)成熟，重復(fù)性好，放大只需簡單的增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量等優(yōu)點。 但也有其缺點：勞動強度大，占地空間大，單位體積提供細胞生長的表面積小，細胞生長密度低，培養(yǎng)時監(jiān)測和控制環(huán)境條件受到限制等。 現(xiàn)在使用的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)包括二氧化碳培養(yǎng)箱和轉(zhuǎn)瓶機兩類。

反應(yīng)器貼壁培養(yǎng) 此種培養(yǎng)方式中，細胞貼附于固定的表面生長，不因為攪拌而跟隨培養(yǎng)液一起流動，因此比較容易更換培養(yǎng)液，不需要特殊的分離細胞和培養(yǎng)液的設(shè)備，可以采用灌流培養(yǎng)獲得高細胞密度，能有效地獲得一種產(chǎn)品；但擴大規(guī)模較難，不能直接監(jiān)控細胞的生長情況，故多用于制備用量較小、價值高的生物藥品。

CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反應(yīng)器是常用的貼壁培養(yǎng)式生物反應(yīng)器，用于細胞貼壁培養(yǎng)時可用籃式攪拌系統(tǒng)和圓盤狀載體。此載體是直徑6毫米無紡聚酯纖維圓片，具很高表面積與體積比（1200cm2/g），利于獲得高細胞密度?；@式攪拌系統(tǒng)和載體培養(yǎng)是目前貼壁細胞培養(yǎng)使用多方式，用于雜交瘤細胞、Hela細胞、293細胞、CHO細胞及其它細胞培養(yǎng)。此種方式培養(yǎng)細胞，細胞接種后貼壁快。

三、懸浮培養(yǎng)（suspension culture）：是指細胞在反應(yīng)器中自由懸浮生長的過程。主要用于非貼壁依賴型細胞培養(yǎng)，如雜交瘤細胞等；是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)通起來的。

無血清懸浮培養(yǎng)是用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細胞培養(yǎng)方式，它能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，正逐漸成為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的研究新方向。

四、固定化培養(yǎng)（immobilization culture）：是將動物細胞與水不溶性載體結(jié)合起來，再進行培養(yǎng)。上述兩大類細胞都適用，具有細胞生長密度高，抗剪切力和抗污染能力強等優(yōu)點，細胞易于產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物分離純化。制備方法很多，包括吸附法、共價貼附法、離子/共價交聯(lián)法、包埋法、微囊法等。

1、吸附法:用固體吸附劑將細胞吸附在其表面而使細胞固定化的方法稱為吸附法（adhesion）。操作操簡便、條件溫和、是動物細胞固定化中早研究使用的方法。缺點是：載體的負荷能力低，細胞易脫落。微載體培養(yǎng)和中空纖維培養(yǎng)是該方法的代表，稍后專門介紹。人惡性黑色素瘤細胞

JAR細胞，人絨癌細胞

JEG 細胞，人絨毛膜癌細胞

JEG-3細胞，人絨毛膜癌細胞

Bewo細胞，人絨毛膜腫瘤細胞

BT-474細胞，人乳癌細胞

MNK-7*細胞，人乳癌細胞

ZR-75-1細胞，人乳癌細胞

HTB-75細胞，人乳突狀卵巢腺癌細胞

Caov-3細胞，人乳突狀卵巢腺癌細胞

HBL-100細胞，人乳腺細胞

ADR細胞，人乳腺癌細胞

BC-009細胞，人乳腺癌細胞

BC-019細胞，人乳腺癌細胞

BC-020細胞，人乳腺癌細胞

BC-021細胞，人乳腺癌細胞

BC-022細胞，人乳腺癌細胞

Bcap-37細胞，人乳腺癌細胞

BT-20細胞，人乳腺癌細胞

HCC1937細胞，人乳腺癌細胞

Hs 578T細胞，人乳腺癌細胞

MCF 7B細胞，人乳腺癌細胞

MCF-7細胞，人乳腺癌細胞

MDA-MB-157細胞，人乳腺癌細胞

MDA-MB-231細胞，人乳腺癌細胞

MDA-MB-361細胞，人乳腺癌細胞

MDA-MB-415細胞，人乳腺癌細胞

MDA-MB-436細胞，人乳腺癌細胞

MDA-MB-453細胞，人乳腺癌細胞

MDA-MB-468 細胞，人乳腺癌細胞

MDA-MB-468-06細胞，人乳腺癌細胞

MX-1 細胞，人乳腺癌細胞

SK-BR-3細胞，人乳腺癌細胞

ZR-75-30細胞，人乳腺癌細胞

MDA-MB-435 細胞，人乳腺癌高轉(zhuǎn)移細胞

MCF-7B細胞，人乳腺癌系細胞

HCC38細胞，人乳腺導(dǎo)管癌細胞

MDA-MB-175VII細胞，人乳腺導(dǎo)管癌細胞

MDA-MB-435S細胞，人乳腺導(dǎo)管癌細胞

UACC-812細胞，人乳腺導(dǎo)管癌細胞

BT-549細胞，人乳腺管癌細胞

T-47D細胞，人乳腺管癌細胞

CCD-1095Sk細胞，人乳腺浸潤性導(dǎo)管癌旁皮膚細胞

SK-BR-3*細胞，人乳腺腺癌細胞

SW 1353細胞，人軟骨肉瘤細胞

GNM 細胞，人上頜牙齦癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌細胞

T6細胞，人舌癌細胞

TSCCA細胞，人舌鱗癌細胞

CAL 27細胞，人舌鱗癌細胞

Tca-8113細胞，人舌鱗癌細胞

TSCCa細胞，人舌鱗癌細胞

CRT 細胞，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞

U251細胞，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞

SH-SY5Y細胞，人神經(jīng)瘤細胞

BE(2)-M17細胞，人神經(jīng)母瘤細胞

CRL-2268細胞，人神經(jīng)母瘤細胞

IMR-32細胞，人神經(jīng)母瘤細胞

SH-5Y5Y細胞，人神經(jīng)母瘤細胞

SK-N-AS細胞，人神經(jīng)母瘤細胞

SK-N-BE(2)細胞，人神經(jīng)母瘤細胞

SK-N-MC細胞，人神經(jīng)上皮瘤細胞

A-498細胞，人腎癌細胞

A498-EGFP-puro細胞，人腎癌細胞

ACHN細胞，人腎癌細胞

KC細胞，人腎癌細胞

OS-RC-2細胞，人腎癌細胞

G-401細胞，人腎癌Wilms細胞

SK-NEP-1細胞，人腎母瘤細胞

SW-13細胞，人腎上腺皮質(zhì)癌細胞

NCI-H295R細胞，人腎上腺皮質(zhì)腺癌細胞人惡性黑色素瘤細胞

2、共價貼附法:利用共價鍵將動物細胞與固相載體結(jié)合的固定化方法稱為共價貼附法（attachment by covalent bonding）。此法可減少細胞的泄漏，但須引入化學(xué)試劑，對細胞活性有影響，且因貼附而導(dǎo)致擴散限制小，細胞得不到保護。

3、離子/共價交聯(lián)法:雙功能試劑處理細胞懸浮液，會在細胞間形成橋而絮結(jié)產(chǎn)生交交聯(lián)作用，此固定化細胞方法稱為離子/共價交聯(lián)法（cross-linking by covalent bonding）。交聯(lián)試劑會使一些細胞死亡，也會產(chǎn)生擴散限制。

4、包埋法:將細胞包埋在多孔載體內(nèi)部制成固定化細胞的方法稱為包埋法（entrapment）。優(yōu)點是：步驟簡便、條件溫和、負荷量大、細胞泄漏少，抗機械剪切。缺點是：擴散限制，并非所有細胞都處于佳基質(zhì)濃度，且大分子基質(zhì)不能滲透到高聚物網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部。一般適用于非貼壁依賴型細胞的固定化，常用載體為多孔凝膠，如瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白。

5、微囊法（microencapsulation）:是用一層親水的半透膜將細胞包圍在珠狀的微囊里，細胞不能逸出，但小分子物質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜；囊內(nèi)是種微小培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護細胞少受損傷，故細胞生長好、密度高。微囊直徑控制在200-400μm為宜。制備中應(yīng)注意：

溫和、快速、不損傷細胞，盡量在液體和生理條件下操作；

所用試劑和膜材料對細胞害；

膜的孔徑可控制，必須使?fàn)I養(yǎng)物和代謝物自由通過；

膜應(yīng)有足夠機械強度抵抗培養(yǎng)中攪拌。

五、抗凋亡策略在細胞大規(guī)模培養(yǎng)中的應(yīng)用

生物反應(yīng)器動物細胞大規(guī)模生產(chǎn)過程中，細胞凋亡在細胞死亡中占主要部分。近研究顯示在大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器中細胞的死亡中80%是凋亡所導(dǎo)致,而不是以前所認為的壞死。而在大規(guī)模細胞培養(yǎng)中，細胞死亡是維持細胞高活性和高密度的大障礙。理論上講，防止或延長細胞死亡，可以大提高生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白的產(chǎn)量。

細胞凋亡由一系列基因地調(diào)控，是多細胞生物發(fā)育和維持穩(wěn)態(tài)所必需的生理現(xiàn)象。已知凋亡的終執(zhí)行者是Caspase家族，它們均為半胱氨酸蛋白酶，各識別一個4氨基酸序列，并在識別序列C端天冬氨酸殘基處將底物切斷。Caspase含有可被自身識別的序列，可以切割活化自身而導(dǎo)致信號放大，并作用于下游Caspase成員，從而形成Caspase家族的級聯(lián)放大，終作用于效應(yīng)蛋白，引起細胞凋亡。

所以在大規(guī)模培養(yǎng)時干擾細胞在培養(yǎng)中凋亡的發(fā)生，提高細胞特異性抵制遇到壓力而引起凋亡的能力，有利于提高細胞的培養(yǎng)密度、延長細胞的培養(yǎng)周期，從而提高目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量2-3倍。

1、營養(yǎng)物質(zhì)抗凋亡

在常規(guī)生物反應(yīng)器構(gòu)造中，營養(yǎng)耗竭或缺乏培養(yǎng)基中特殊的生長因子則引起凋亡，例如血清，糖或特殊氨基酸的耗盡。培養(yǎng)基中添加氨基酸或其它關(guān)鍵營養(yǎng)可抑制凋亡、延長培養(yǎng)時間從而提高產(chǎn)品的生產(chǎn)。大規(guī)模培養(yǎng)中細胞凋亡主要由于營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭或代謝產(chǎn)物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)凋亡。另外，動物細胞在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時，細胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。

2、基因抗凋亡

與凋亡相關(guān)的一系列基因產(chǎn)物可對其進行正、負向的調(diào)控，因此可通過導(dǎo)入相應(yīng)基因來調(diào)節(jié)細胞凋亡的機制。Bcl-2基因是目前為有效的抗凋亡基因，在多種細胞系中均表現(xiàn)出很強的抗凋亡活性。

3、化學(xué)方法抗凋亡

凋亡發(fā)生時細胞許多部位發(fā)生生化物質(zhì)的改變，有些變化如改變細胞氧化還原條件產(chǎn)生活性氧在凋亡信號階段發(fā)生，其它的如破壞線粒體膜電位、激活caspase則發(fā)生在凋亡效應(yīng)階段，這在大多數(shù)細胞死亡中是相同的。因此,阻止這些生化物質(zhì)的改變可能阻止或至少延遲細胞凋亡的發(fā)生，運用化學(xué)物質(zhì)可抑制信號效應(yīng)階段的發(fā)生，被認為是抗調(diào)亡策略之一。

人惡性黑色素瘤細胞