開(kāi)學(xué)季，買(mǎi)人黑色素瘤株細(xì)胞，更多好禮相送，買(mǎi)的超值，買(mǎi)的舒心 訂購(gòu)熱線：

購(gòu)買(mǎi)素爾生物人黑色素瘤株細(xì)胞注意事項(xiàng)如下：

1 收到細(xì)胞后先觀察T-25瓶是否有損壞、漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系。

2 對(duì)于貼壁細(xì)胞，若細(xì)胞漂?。号囵B(yǎng)瓶不開(kāi)封，用75%酒精擦拭后平躺置于培養(yǎng)箱內(nèi)。次日觀察，如細(xì)胞大部分又貼回瓶底，表明細(xì)胞活力正常，剩余漂浮的細(xì)胞可以去掉；如細(xì)胞還不貼壁，將細(xì)胞離心收集移到新的培養(yǎng)瓶中，原培養(yǎng)瓶加部分培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，中間注意觀察，我們的技術(shù)人員會(huì)一直跟蹤指導(dǎo)，直到問(wèn)題解決。

3 建議客戶收到細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和本公司技術(shù)部溝通交流。人黑色素瘤株細(xì)胞

第五節(jié) 無(wú)血清技術(shù)及其培養(yǎng)基

經(jīng)歷了天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無(wú)血清培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)成為當(dāng)今細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的一大趨勢(shì)。采用無(wú)血清培養(yǎng)可降低生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化分離純化步驟，避免病毒污染造成的危害。

無(wú)血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的完全培養(yǎng)基可以滿足大部分細(xì)胞培養(yǎng)的要求，但對(duì)有些實(shí)驗(yàn)卻不適合，如觀察一種生長(zhǎng)因子對(duì)某種細(xì)胞的作用，這時(shí)需要排除其他生長(zhǎng)因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長(zhǎng)因子；又如需要測(cè)定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長(zhǎng)因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。因此研制出無(wú)血清培養(yǎng)基一直是生物科學(xué)工作者努力的目標(biāo)。上海恒利安生物科技有限公司已成功開(kāi)發(fā)了商業(yè)化的多種無(wú)血清培養(yǎng)基，可滿足眾多廠商的需求。

一、無(wú)血清培養(yǎng)基的基本配方:基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。

用于生物制藥和疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，多數(shù)呈貼壁生長(zhǎng)或兼性貼壁生長(zhǎng)；而當(dāng)其在無(wú)血清、無(wú)蛋白培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細(xì)胞往往以懸浮形式生長(zhǎng)。

添加組分包括以下幾大類(lèi)物質(zhì)：

(1）促貼壁物質(zhì)：許多細(xì)胞必須貼壁才能生長(zhǎng)，這種情況下無(wú)血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴(kuò)展因子，一般為細(xì)胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細(xì)胞功能的分化因子，對(duì)許多細(xì)胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進(jìn)來(lái)自中胚層細(xì)胞的貼壁與分化，這些細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞、粒細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、CHO細(xì)胞、成肌細(xì)胞等。

(2）促生長(zhǎng)因子及激素：針對(duì)不同細(xì)胞添加不同的生長(zhǎng)因子。激素也是刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、維持細(xì)胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細(xì)胞必不可少的，如胰島素。

(3）酶抑制劑：培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，需要用胰酶消化傳代，在無(wú)血清培養(yǎng)基中必不可少須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。常用的是大豆胰酶；抑制劑。

(4）結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：常見(jiàn)如轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。

(5)微量元素：硒是常見(jiàn)的。

二、使用方法:目前，血清仍是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中基本的的添加物，尤其是在原代培養(yǎng)或者細(xì)胞生長(zhǎng)狀況不良時(shí)，常常會(huì)先使用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛以后，再換成無(wú)血清培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個(gè)適應(yīng)過(guò)程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無(wú)血清培養(yǎng)。在降低過(guò)程中要注意觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細(xì)胞死亡，存活細(xì)胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實(shí)驗(yàn)后這些細(xì)胞一般不再繼續(xù)保留，很少有細(xì)胞能夠長(zhǎng)期培養(yǎng)于無(wú)血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)之前，要留有種子細(xì)胞，種子細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，以保證細(xì)胞的特性不發(fā)生變化。

為了使細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)，關(guān)鍵的是使所培養(yǎng)細(xì)胞：

處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期

>90% 活細(xì)胞率

適應(yīng)時(shí)以較高的起始細(xì)胞接種

SK-CO-1細(xì)胞，人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞

SW837細(xì)胞，人結(jié)直腸腺癌上皮細(xì)胞

Dami細(xì)胞，人巨核白血病細(xì)胞

801-D 細(xì)胞，人巨性肺癌細(xì)胞

CRL-7729細(xì)胞，人口腔癌細(xì)胞

KB細(xì)胞，人口腔表皮樣癌細(xì)胞

TSC-15細(xì)胞，人口腔鱗癌細(xì)胞

HN13細(xì)胞，人口腔鱗狀癌細(xì)胞

UT-7細(xì)胞，人類(lèi)原巨核白血病細(xì)胞

Daudi細(xì)胞，人淋巴瘤細(xì)胞

RMA-S細(xì)胞，人淋巴瘤細(xì)胞

Romas細(xì)胞，人淋巴瘤細(xì)胞

T2(174×CEM.T2)細(xì)胞，人淋巴母細(xì)胞

SW1910細(xì)胞，人卵巢癌細(xì)胞

3AO細(xì)胞，人卵巢癌細(xì)胞

TOV-21G細(xì)胞，人卵巢癌細(xì)胞

CoC1/DDP細(xì)胞，人卵巢癌CoC1順鉑耐藥亞株細(xì)胞

A2780/DDP細(xì)胞，人卵巢癌耐DDP細(xì)胞

PA-1細(xì)胞，人卵巢畸胎瘤細(xì)胞

ES-2細(xì)胞，人卵巢透明癌細(xì)胞

K562細(xì)胞，人慢性髓原白血病細(xì)胞

K562-A細(xì)胞，人慢性髓原白血病細(xì)胞

HCE-8962細(xì)胞，人盲腸未分化癌細(xì)胞

HCT-8細(xì)胞，人盲腸腺癌細(xì)胞

Hce-8693細(xì)胞，人盲腸腺癌（未分化）細(xì)胞

HNE1/DDP細(xì)胞，人耐DDP鼻咽癌細(xì)胞

MCF-7/ADR細(xì)胞，人耐阿霉素乳腺癌細(xì)胞

HCT-8/VCR細(xì)胞，人耐長(zhǎng)春新堿結(jié)腸癌細(xì)胞

SGC-7901/VCR細(xì)胞，人耐長(zhǎng)春新堿胃腺癌細(xì)胞

A172細(xì)胞，人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞

HS 683細(xì)胞，人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞

SHG-44細(xì)胞，人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞

TG-905 細(xì)胞，人腦膠質(zhì)母瘤細(xì)胞

SF126細(xì)胞，人腦瘤細(xì)胞

SF17細(xì)胞，人腦瘤細(xì)胞

SF763細(xì)胞，人腦瘤細(xì)胞

SF767細(xì)胞，人腦瘤

H4細(xì)胞，人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞

U-373MG細(xì)胞，人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞

有兩種方法使細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基（SFM）:

1、直接適應(yīng)——細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無(wú)血清培養(yǎng)基（SFM）中。

一些類(lèi)型細(xì)胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基。對(duì)于直接適應(yīng)，接種細(xì)胞密度應(yīng)該:2.5×10⁵~3.5×10⁵細(xì)胞/ml。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁶~3×10⁶細(xì)胞/ml時(shí)，傳代培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度在培養(yǎng)4到7天后達(dá)到2×10⁶~4×10⁶細(xì)胞/ml時(shí)，細(xì)胞完全適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基。每隔3~5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁶~3×10⁶細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90％時(shí)，貯備的適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

2、連續(xù)適應(yīng)——分好幾步把細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無(wú)血清培養(yǎng)基（SFM）中，與直接適應(yīng)相比較，連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩?xì)胞更加溫和一些。

以2倍正常接種密度接種生長(zhǎng)活躍的細(xì)胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基：25％SFM 混合培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)。

當(dāng)細(xì)胞密度>5×10⁵細(xì)胞/ml時(shí)，以2×10⁵到3×10⁵細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，在有血清培養(yǎng)基：SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

以2×10⁶到3×10⁶細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，25％有血清培養(yǎng)基和75% SFM中傳代培養(yǎng)。

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁶到3×10⁶細(xì)胞/ml（接種后4到6天），在100％SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。人黑色素瘤株細(xì)胞

每隔3到5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁶到3×10⁶細(xì)胞/ml，細(xì)胞活率在90％時(shí)，貯備的適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物，直到每一次細(xì)胞適應(yīng)了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進(jìn)行幾次傳代。

在適應(yīng)過(guò)程中，不要讓細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養(yǎng)基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì)，因而更易于受外界因素的影響。

細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)替代血清：許多細(xì)胞利用連續(xù)適應(yīng)方法能很好的適應(yīng)，用包含F(xiàn)BS的的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基1∶1（v∶v）的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。通過(guò)下列的混合培養(yǎng)基的方式，連續(xù)幾代減少當(dāng)前培養(yǎng)基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培養(yǎng)基。每次適應(yīng)改變血清比例時(shí)，傳代細(xì)胞2到3次。

培養(yǎng)可以直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清。一開(kāi)始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長(zhǎng)的延遲可能會(huì)發(fā)生，4允許進(jìn)行2到3次的傳代，使生長(zhǎng)率恢復(fù)到以前的水平。

特別需要強(qiáng)調(diào)的是：配制無(wú)血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水，如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因?yàn)闊o(wú)血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護(hù)細(xì)胞的大分子，既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微，也可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生致死性損害。這是無(wú)血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。

三、使用無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)

增加確定性

性能更加一致

容易進(jìn)行純化和下游加工

細(xì)胞功能的評(píng)估

增強(qiáng)生長(zhǎng)和/或產(chǎn)量

生理反應(yīng)性的較好對(duì)照

增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)中介物的檢測(cè)

人黑色素瘤株細(xì)胞