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細(xì)胞養(yǎng)不好?這些注意事項(xiàng)請收好(三)

發(fā)布時(shí)間:2018-11-28瀏覽次數(shù):1593返回列表

【技術(shù)文章】細(xì)胞養(yǎng)不好?這些注意事項(xiàng)請收好(三


1、購買的細(xì)胞死亡或存活率不佳可能原因?細(xì)胞冷凍管解凍后,為何會(huì)有細(xì)胞數(shù)目太少的情形?


研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳,常見原因可歸納為:培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳;血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳;解凍過程錯(cuò)誤;冷凍細(xì)胞解凍后,加以洗滌細(xì)胞和離心;懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞;培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤;細(xì)胞置于 –80 ℃ 太久。


研究人員在冷凍細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少,大都是因?yàn)殡x心過程操作上的失誤,造成細(xì)胞的物理性損傷,以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心,應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。


2、收到的冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落的原因?


冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng),造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫,是因熱脹冷縮的物理現(xiàn)象,冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí),均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。



3、如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基?


培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在 MEM 中培養(yǎng)的細(xì)胞,很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長??傊?,先選 MEM 做粘附細(xì)胞培養(yǎng),RPMI-1640 做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開始,各種目的無血清培養(yǎng)zui好shou選 AIM V(12005)培養(yǎng)基(SFM)。


4、L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎?它在溶液中不穩(wěn)定嗎?


L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解,但是確切的降解率一直沒有zui終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成,而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。



5、GlutaMAX-I 是什么?培養(yǎng)細(xì)胞如何利用 GlutaMAX-I?這個(gè)二肽有多穩(wěn)定?


GlutaMAX-I 二肽是一個(gè) L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩(wěn)定的 alpha-氨基用 L-丙氨酸來保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放 L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常穩(wěn)定,即使在 121 磅滅菌 20 分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有zui小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎完全降解。


6、什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅?培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么?


酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為 PH 值的指示劑:中性時(shí)為紅色,酸性時(shí)為黃色,堿性時(shí)為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用(特別是雌激素)。為避免固醇類反應(yīng),培養(yǎng)細(xì)胞,尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí),用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時(shí),不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。



丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源,盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。


7、為什么目錄上說 Hank's 平衡鹽溶液 (HBS) 在空氣中使用,不需要 CO2 培養(yǎng)箱?HBS 和 Earle's 平衡鹽溶液 (EBS) 有什么本質(zhì)的功能差別?


HBS 和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在 Eagles (2.2 g/L) 中比在 Hanks (0.35 g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的 CO2 平衡,以維持溶液的 PH 值。Eagles 液在空氣水平的 CO2 中,溶液會(huì)變堿,Hanks 液在 CO2 培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在 CO2 培養(yǎng)箱中保存組織,需要用 Eagles 液,如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織,用 Hanks 液就可以了。


8、二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時(shí)加入 EDTA 的目的是什么?


二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前,用 EDTA 清洗細(xì)胞,以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。


9、其他注意事項(xiàng)


o 當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí),降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的 50%。血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下,抗生素不被滅活,可能對于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。


o 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí),您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。


o 大部分添加物和試劑zui多可以凍融 3 次,如果次數(shù)更多都會(huì)在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,將會(huì)影響它的性能。


o 在溶解的一周內(nèi)使用貯存在 4℃ 冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在 4℃ 就可能開始降解,如果在室溫下放置超過 30 分鐘,就會(huì)變得不穩(wěn)定。


o 為了保持 CO2 培養(yǎng)箱水盤清潔,需定期 (至少每兩周一次) 用無菌蒸餾水或無菌去離子水更換。